Трансфекция с липофектамином

Липофекция (lipofection) — перенос в эукариотические клетки ДНК, РНК или других компонентов, инкапсулированных в липосомы. Метод липофекции основан на взаимодействии между положительно заряженными молекулами фосфолипидов, из которых состоят липосомы, и отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот.

Общая информация

В настоящее время липофекцию мы проводим с помощью набора реагентов Lipofectamine 3000, который состоит из двух компонентов: Lipofectamine 3000 и энхансер трансфекции P3000. Хотя детального описания состава найти не удается, по всей видимости Липофектамин 3000 представляет собой cмесь липидов, а P3000 - это рекомбинантный таргетный катионный полипептид. Взаимодействуя с ДНК, липофектамин и P3000 образуют липополиплексы - микроскопические липидные везикулы, содержащие сконденсированную под действием катионного полипептида ДНК.

Липополиплексы с ДНК проникают в клетки посредством эндоцитоза. Обычно образовавшиеся в результате этого эндосомы с липидными везикулами внутри созревают в лизосомы и подвергают ДНК деградации, но благодаря P3000 везикулы липофектамина сливаются с мембраной эндосом, высвобождая генетический материал в цитоплазму.

Протокол трансфекции c Lipofectamine 3000

Протокол простой и состоит из нескольких этапов:

  1. Довести концентрацию ДНК до 0.5-5 мкг/мкл. На одну трансфекцию требуется в 96w требуется 0.1-0.2 мкг ДНК, в 24w 0.5-1 мкг (24-well), 2.5-5 мкг (6-well).
  2. Дорастить клетки до конфлюэнтности 70%-90% в привычной для них среде. При такой плотности достигается минимальная токсичность липофектамина и максимальная эффективность трансфекции. Производитель советует каждую трансфекцию проводить в двух вариантах с разным количеством липофектамина, поэтому пока оптимальные условия не будут подобраны, на одну конструкцию нужно минимум две лунки с клетками. Не обязательно делать две трансфекции, если есть уверенность, что какая-то концентрация липофектамина подойдет лучше.
  3. Развести липофектамин 3000 в среде без сыворотки Opti-MEM как показано в таблице ниже. Нужно обратить внимание, что в таблице производитель указывает цифры из учета, что трансфекция будет проводиться в двух вариантах, как сказано выше, то есть на каждую конструкцию будет сделано две аликвоты с разным количеством липофектамина.
  4. Развести ДНК и P3000 в среде без сыворотки Opti-MEM как показано в таблице ниже. Объем полученной смеси должен равняться объему разведенного липофектамина. P3000 добавляется из расчета 2 мкл на мкг ДНК. P3000 образует комплекс с ДНК и облегчит формирование липосом. Нужно обратить внимание, что в мануале производителя объем раствора ДНК+P3000 соответсвует двум трансфекциям и поровну делится между двумя пробирками с разведенными Lipofectamine 3000.
  5. Смешать каждую аликвоту разведенного липофектамина с равным объемом ДНК+P3000. Инкубировать 10-15 минут при КТ.
  6. Добавить весь объем ДНК-липидного комплекса прямо в лунку с клетками в их привычной среде. Производитель утверждает, что менять среду не обязательно по крайней мере в течение 2х дней.. По нашему опыту, если речь идет о мышиных эмбриональных стволовых клетках, менять среду нужно через 8 часов во избежание цитотоксичности липофектамина.

В случае с pMAX-GFP первые признаки трансформации появляются уже через полдня

Используйте указанные в таблице ниже количества Opti-MEM в независимости от объемов ДНК, P3000 и липофектамина.

Дополнительная информация

Протокол от Thermo Описание, мануалы, FAQs на сайте производителя Wikipedia про липофектамин