Приготовление электрокомпетентных клеток - это простая, но трудоемкая процедура, вся суть которой заключается в том, чтобы нарастить клетки в питательной среде до фазы экспоненциального роста, затем отмыть клетки суперчистой водой и ресуспендировать в буфере для заморозки. Проблема заключается в том, что компетентность клеток E.coli в результате электропорации зависит от огромного количества факторов. В первую очередь, это (1) клеточный штамм, (2) температурный режим, (3) плотность культуры на старте отмывки, (4) качество отмывки, (5) плотность замороженных клеток. Так или иначе все протоколы приготовления электрокомпетентных клето очень мохожи, но отличаются в деталях. Протокол, предложенный ниже опробован на клетках E.coli штамма TOP10. В моих руках компетентность доходит до десяти в восьмой-девятой степени, что может быть даже слишком большим для рутинного клонирования.
Штамм клеток TOP10 является стрептомицин-резистентным. Клетки этого штамма считаются ультракомпетентными, поскольку компетентность их достигает 109 -1010 КОЕ/мкг в зависимости от производителя. На практике без проблем удается получать значения порядка 108. Благодаря мутации lacZΔM15 штамм подходит для сине-белой селекции. Штамм не содержит F’-эписому и поэтому не подходит для клонирования конструкций, содержащих ccdB, что позволяет использовать TOP10 для негативной селекции gateway. Плазмиды, нарощенные в TOP10 будут метилированы, что надо учитывать при работе с метил-чувствительными рестриктазами.
| 2xYT | 250 мл | 1 л | 2л | 3л | 4л |
|---|---|---|---|---|---|
| Триптон | 4 г | 16 г | 32 г | 48 г | 64 г |
| NaCl | 1.25 г | 5 г | 10 г | 15 г | 20 г |
| Дрожжевой экстракт | 2.5 г | 10 г | 20 г | 30 г | 0 г |
10 см чашка Петри с LB-агарозой + стрептомицин (100 мкг/мл)
Для УФ-селекции 20 см чашка Петри с LB-агарозой + стрептомицин (опционально)
Бутылка с 250 мл автоклавированной 2хYT или LB (используется для приготовления ночной культуры)
4 л mQ (автоклавированной)
100 мл 10% (v/v) глицерола
| 10% глицерин | 50 мл | 100 мл | 150 мл | 200 мл | 250 мл |
|---|---|---|---|---|---|
| Глицерин | 5 мл | 10 мл | 15 мл | 20 мл | 25 мл |
| mQ | 45 мл | 90 мл | 135 мл | 180 мл | 225 мл |
100 мл 10% (v/v) глицерола
Стоковый раствор стрептомицина в mQ (100 мг/мл, считается 1000-кратным), не менее 100 мкл.
Центрифужные стаканы Beckman на 0.5 л и 26 мл (по две штуки на колбу).
Теплая одежда
Клетки E.coli крайне чувствительны к температурному режиму. Любой резкий перепад температуры может полностью обнулить компетентность. так что начиная со стадии отмывок все манипуляции проводятся исключительно на льду и в холодной комнате на +4С.
Рассеять клетки TOP10 раскаленной петлей прямо из стока на 10 см чашку Петри с LB агарозой + стрептомицином, растить ночь при 37С. На следующий день поставить в холодильник.
(УФ-селекция, опционально)Выбрать на 10 см чашке четыре-восемь колоний, пометить, и пересадить на одну 20 см чашку с LB-агарозой+стрептомицин параллельными полосами на равном расстоянии друг от друга. Сколько колоний - столько и полос. Микробиологическая петля должна проходить по поверхности агара, и не погружаться внутрь. Мысленно разбить чашку перпендикулярно полосам на пять секторов равной ширины. Сразу обработать сектора ультрафиолетом с разной продолжительностью (например: 0, 15, 30, 45, 60 секунд). Поставить чашку в инкубатор на ночь. На следующий день определить, какая из выбранных на 10 см чашке колоний теряет способность к размножению под действием УФ.
Выбранную колонию пересадить в 20 мл 2xYT+ стрептомицин, инкубировать при 37С и в качалке 180-250 об/мин.
На следующий день отобрать из колбы с 2xYT 1-5 мл среды и сохранить для спектрофотометрического контроля.
Инокулировать колбы добавлением 10 мл ночной культуры. Антибиотик в колбу добавлять не нужно!
Инкубировать колбы в качалке при 37С 180-250 об/мин.
Перенести банки с mQ, глицерином, коробки с пробирками, носиками, пипетки, центрифужные стаканы на 0.5л и 26 мл в холодную комнату, желательно поставить там таз с мокрым льдом.
Дорастить клетки до AD600 =0.6 (допустимо значение между 0.5-0.9). По моему опыту это занимает всегда почти ровно 3 часа c момента инокуляции.
По достижении нужной плотности незамедлительно перенести колбы в таз со льдом в холодную комнату. Инкубировать 15-30 минут. В это время нужно охладить ротор центрифуги до 4С.
Перелить содержимое колб в 0.5л центрифужные стаканы. На одну колбу нужно два стакана. Хотя можно обойтись и одним. Обязательно уравновешивать на весах! Центрифугировать стаканы в холодном роторе, 4000 g, 10 мин, 4С.
Аккуратно слить супернатант, не растрясывая осадок. Если требуется, залить остатки клеточной суспензии в тот же стакан и повторить центрифугирование.
Залить 150 мл холодной mQ (где-то половина стакана),
расуспендировать, долить до 400 (почти полный стакан) и перемешать. Обязательно уравновесить все стаканы на весах!
Центрифугировать при 4000 g, 10 мин, 4С. Аккуратно слить супернатант, не растрясывая осадок.
Слить супер, залить ~100 мл холодной воды (где-то четверть стакана),
расуспендировать, долить до 200 мл (почти половина стакана). Обязательно уравновесить все стаканы на весах!
Центрифугировать при 4000 g, 10 мин, 4С.
Слить супернатант не задевая осадок., ресуспендировать осадок в каждом стакане в 10 мл 10% ледяного глицерола и попарно объединить в 26 мл стаканах. Обязательно уравновесить все стаканы на весах!
Центрифугировать при 4000 g, 10 мин, 4С. Аккуратно удалить супернатант, не задевая осадок.
Слить супернатант, ресуспендировать осадок в каждом стакане в 1 мл 10% глицерола. Расфасовать в пробирки по 50 мкл. На один стакан выходит где-то 40 пробирок.
Заморозить клетки в кельвинаторе. Хранить при -70 до использования. Транспортировать в сухом льду или жидком азоте.
Готовые клетки можно заморозить в жидком азоте или на сухом льду. Считается, что от этого клетки лучше переносят заморозку и компетентность получается выше.
Известно, что чем выше объем, в котором ресуспендируют клетки перед заморозкой - тем ниже компетентность. С другой стороны, чем меньше объем - тем выше концентрация солей и больше вероятность пробоя. Так что здесь нужно найти свою золотую середину. В некоторых случаях стоит ресуспендировать клетки в большем объеме. Знающие люди советуют перед фасовкой доводить объем клеток до 1:500 от начального объема культуры. Мой опыт говорит, что чем меньше объем ты делаешь - тем лучше надо отмывать клетки.
Все манипуляции с осажденными клетками нужно проводить с максимальной бережностью.Чем больше клеток попадет в слив, тем меньше будет компетентность.