Очистка на магнитных шарах

Твердофазные шарики с обратимой иммобилизацией (Solid Phase Reversible Immobilisation beads, SPRI) были разработаны в Институте Уайтхеда (DeAngelis et al, 1995) в качестве дешевого, быстрого и эффективного метода очистки ПЦР. Гранулы (шарики) SPRI являются парамагнитными (магнитные свойства проявляются только в магнитном поле), что предотвращает их слипание и выпадение из раствора. Каждая гранула сделана из полистирола, окруженного слоем магнетита, который покрыт карбоксильными группами. Именно они обратимо связывают ДНК в присутствии «вытесняющего агента» - полиэтиленгликоля (ПЭГ) и соли (20% ПЭГ, 2,5 М NaCl). ПЭГ и ионы натрия заставляют отрицательно заряженную ДНК связываться с карбоксильными группами на поверхности гранул. Поскольку иммобилизация зависит от концентрации ПЭГ и соли в реакции, объемное отношение гранул к ДНК имеет решающее значение.

Шарики SPRI отлично подходят для очистки ДНК с низкой концентрацией, поэтому он используется во многих наборах. Связывающая способность шариков SPRI огромна. 1 мкл AmpureXP свяжет более 3 мкг ДНК. Процедура очистки весьма проста и занимает около 20-30 минут. Поскольку очистка основана на преципитации ДНК в присутствии PEG, доля полиэтиленгликоля в смеси ДНК с шарами определяет размер фрагментов, осаждающихся на шарах. Чем меньше доля PEG, тем длинее должны быть фрагменты ДНК, чтобы оказаться на шарах. Соответственно, изменяя соотношение шары:образец можно проводить селекцию ДНК по размеру.

Влияние соотношения шары:образец на очистку маркера с помощью SPRI. Чем меньше шаров добавляется, тем выше граница размерной селекции. Это также позволяет проводить двустороннюю селекцию: выделять ДНК, ограниченную размерами сверху и снизу (для примера, можно посмотреть мануал SPRIselect). Шары разных торговых марок дают разную картинку!

Для очистки ДНК из реакционных смесей мы используем AMPure XP beads [Beckman A63880], которые хорошо подходят для очистки ДНК из реакционных смесей. У шариков достаточно скудный мануал, так что подходят они главным образом для очистки ПЦР-продуктов от фрагментов меньше ~400 пар.

Шары от других производителей имеют аналогичный протокол, однако может сильно варьировать соотношений объема шаров к образцу.

Протокол односторонней селекции с AMPure XP beads

  • Выдержать шары при комнатной температуре в течение 20 минут

  • Определить нужный для очистки ДНК объем шаров. Для очистки ПЦР от праймеровых димеров (димеры 20-40 пар) используем 1.8x объема от реакции. Например, к 20 мкл ПЦР-смеси нужно добавить 36 мкл шаров AMPure XP. Для очистки от более длинных фрагментов (вплоть до 300-400 пар), стоит ориентироваться на диаграммы ниже (взято отсюда):

Мне удавалось очистить ПЦР продукт ~800 пар от неспецифики ~100-300 пар с помощью 0.6 объема шаров.

  • Смешать образец с нужным объемом шаров в 1.5 мл пробирке

  • Перемешать пипетированием или на вортексе

  • Инкубировать смесь 5-15 минут, чтобы ДНК связалась с шарами

Судя по опыту, более длительная инкубация делает выход выше, однако в большинстве случаев 5 минут достаточно. Если добавляете меньше 1 объема шаров, то стоит инкубировать дольше.

  • Поставить пробирку на магнитный штатив до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (1-2 минуты). В магнитном поле шары притягиваются к стенке с магнитом. Дальнейшие отмывки выполняются на штативе.

  • Удалить супернатант

Нужно следить, чтобы шары не попадали в слив. В носике их достаточно легко заметить, если посмотреть на жидкость в пипетке напросвет. Шарики всегда образуют елезаметный мутный комок, который движется вслед за жидкостью. Если шары попали в носик, то нужно вернут супернатант в пробирку и снова удалить через 30 секунд.

  • Добавить 200 мкл свежего 70% этанола на 30 секунд. Этанол должен покрыть шары.
  • Удалить супернатант
  • Снова добавить 200 мкл свежего 70% этанола на 30 секунд. Этанол должен покрыть шары.
  • Удалить супернатант полностью. Если этанол остался на стенках, то быстро скрутить шары, снова поставить на штатив и удалить остатки жидкости.
  • Высушить шары от этанола. Время сушки 2-5 минут. Чем меньше - тем лучше. Можно ориентироваться по шарикам: сухой осадок шариков становятся матовым и растрескивается.

Производители шаров призывают избегать продолжительной сушки, поскольку пересушивание приводит к падению выхода.

  • Добавить mQ или TE из расчета нужный объем плюс 1-2 мкл

Лишние 2 мкл нужны, чтобы не захватить шары пипеткой во время отбора элюата.

  • Снять пробирку с магнитного штатива, интенсивно перемешать шары пипетированием или на вортексе

  • Инкубировать 2 минуты на столе (без магнита)

  • Если на стенках пробирки видны капли, то скрутить пробирку

  • Поставить пробирку на магнитный штатив на 2 минуты, чтобы шары отделились от супернатанта

  • Перенести элюат в новую пробирку, оставив 1-2 мкл в пробирке

Элюция с шаров дает количественный выход за 2 минуты, так что повторная элюция не требуется. Попадание шаров в образец очищенной ДНК не должно влиять на хранение и последущие реакции с ДНК. В любом случае, очищенный образец можно центрифугировать, чтобы осадить шары на дно пробирки.

Дополнительная информация

Agencourt AMPure XP beads Instruction and FAQ

Как работает метод SPRI

Двусторонняя сайз-селекция ДНК с SPRIselect