Рецепт, проверенный экспертами😀
Чисто технически, можно заменить G-MEM на DMEM. В таком случае клетки не будут чувствовать себя хуже, но скорость роста несколько снизится.
| Компонент | 50 мл | на 500мл банку среды |
|---|---|---|
| G-MEM | 43 мл | 500 мл |
| GlutaMAX | 0.5 мл | 5.8 мл |
| Sodium Pyruvate | 0.5 мл | 5.8 мл |
| MEM-NEAA | 0.5 мл | 5.8 мл |
| Pen/Strep | 0.5 мл | 5.8 мл |
| ES-FBS | 5 мл | 58 мл |
| 𝜷-меркаптоэтанол | 100 мкл | 1,16 мл |
После смешивания среду необходимо аликвотировать по 40-45 мл в фальконы на 50 и заморозить в вертикальном положении.
Новоприготовленные стоки необходимо проверять на стерильность. Для этого необходимо налить 2-3 мл среды в 4-см чашку Петри и поставить в инкубатор на 2-3 дня. Если среда зарастет, то придется отфильтровать весь сток и снова проверить на зарост. Непроверенные среды лучше не использовать для культивирования ES-клеток.
После разморозки в фалькон со средой добавляем mLIF до концентрации 10pg/ml (Sigma) или 1000 U/ml (Gibco), пишем на банке “+LIF”.
Если среда используется для культивирования без фидеров, то дополнительно добавляем CHIR до 3 мкМ и PD до 1 мкМ. В таком случае помечаем фалькон аббревиатурой “2i”.
После добавления LIF ES-среду уже нельзя замораживать! Если LIF подвергнется заморозке, то он потеряет способность стимулировать самообновление ES-клеток, в результате чего все колонии пойдут дифференцироваться.