Реактивы для мЭСК

Ниже для ознакомления указаны реактивы, с которыми нужно будет иметь дело при работе с мЭСК.

Реактивы для ES-среды

Список реактивов, обязательных для работы с эмбриональными стволовыми клетками мышей:

  1. Минимальная среда (G-MEM). Мы используем Glasgow Minimal Essential Medium, G-MEM (Gibco 11710-035)

  2. Фетальная телячья сыворотка, пригодная для ЭСК (ES-FBS). По нашему опыту лучшими являются:

    • HyClone FBS DEFINED Murine ESC Screened (HyClone SH30070.03)

    • Capricorn FBS ES Pretested (Capricorn FBS-ES-12A)

Сыворотки хранятся на -20 градусах. Перед использованием белки системы комплемента в сыворотке должны быть инактивированы. Это достигается нагреванием FBS до 56 градусов в водяной бане в течение 30 минут. После инактивации сыворотку аликвотируют по 40-45 мл в фальконы на 50. Далее фальконы помечают инициалами “iES-FBS” и замораживают в вертикальном положении. Перед аликвотированием стоит дождаться, когда на дно бутылки полностью выпадет осадок.

ES-клеточные FBS - это стандартные FBS, для которых каждая фасовка проверена на способность поддерживать недифференцированное состояние mES-клеток. Теоретически в качестве ES-FBS можно использовать любую фасовку не ES-FBS, на которой mES-клетки сохраняют правильный фенотип в течение длительного промежутка времени. Точно так же, есть вероятность, что фасовка ES-defined сыворотки будет плохо влиять на свойства стволовых клеток

  1. Мышиный Фактор Ингибирований Лейкозных Клеток (mouse Leukemia Inhibitory Factor, mLIF). Мы протестировали два варианта:

    • ESGRO® Recombinant Mouse LIF Protein (MERK ESG1107). Рабочая концентрация 1000 U/ml. Реагент представляет собой высокоочищенный полипептид, растворенный PBS+1%BSA pH7.4 в концентрации 107 U/ml. Ссылка на документацию
    • Recombinant Mouse Leukemia Inhibitory Factor (Gibco PMC9484). Рабочая концентрация 10 нг/мл. Реагент представляет собой порошок лиофилизированного высокоочищенного белка. Ссылка на документацию

ESGRO mLIF должен храниться на +4С на дверце холодильника. Заморозка ESGRO LIF приведет к деградации ингибитора дифференцировки. Среды с добавленным LIF также нельзя замораживать.

Раствор ESGRO mLIF перед первым использованием аликвотируется по 20-50 мкл в эппендорфы. Каждый эппендорф подписывается и складывается в общий пакет !на дверце! в холодильнике +4С, так как у стенок возможна заморозка. Перед использованием фасовку нужно центрифугировать.

Лиофилизированный mLIF Gibco хранится в морозильнике или кельвинаторе. Перед применением необходимо растворить белок в водном растворе 0.1% BSA до концентрации 100 мкг/мл. Полученный раствор аликвотируется по 4-5 мкл в ПЦР-микропробирки, каждая из которых заматывается парафилмом и помещается в эппендорф, чтобы было легче подписывать. Расфасованный Gibco mLIF стоит сразу заморозить в морозильной камере или кельвинаторе. После разморозки нужно хранить белок на +4 и избегать циклов заморозки/разморозки. Среды с добавленным LIF также нельзя замораживать.

  1. Ингибитор Киназы Гликогенсинтазы GSK3/активатор сигнального пути WNT, CHIR99021 (Sigma SML1046). Рабочая концентрация 3 мкМ. Представляет собой белый порошок. Ссылка на развернутое описание

Чтобы приготовить 1000-кратный стоковый 3мМ раствор CHIR, нужно растворить 1 мг порошка в 716 мкл свежего DMSO. Полученный раствор аликвотируется по 50 мкл в эппендорфы, каждая пробирка подписывается и складывается в морозильную камеру на -20С.

  1. Ингибитор сигнального пути MERK/ERK, PD0325901 (Sigma PZ0162). Рабочая концентрация 1 мкМ. Представляет собой белый порошок. Ссылка на развернутое описание

Чтобы приготовить 10000-кратный стоковый 10мМ раствор PD, нужно растворить 1 мг порошка в 207 мкл свежего DMSO. Полученный раствор аликвотируется по 20-25 мкл в эппендорфы, каждая пробирка подписывается и складывается в морозильную камеру на -20С.

Нужно быть внимательным при приготовлении сред с добавлением растворов на DMSO. Максимальная концентрация DMSO в среде для культивации клеток не должна превышать 0.1% из-за токсичности диметилсульфоксида.