HEPES
1M HEPES
HEPES - это цвиттерионный пиперазиновый буферный агент с буферной областью pH 6,8-8,2. HEPES не способен образовывать комплексы с большинством ионов металлов и рекомендуется для использования в качестве некоординирующего буфера в растворах с ионами металлов. Обычно используется в средах для культивирования клеток а также для создания градиента pH при изоэлектрическом фокусировании белков. По сравнению с Tris, HEPES меньше влияет на реакции между ДНК и ферментами рестрикции, поскольку будучи протонированным в меньшей степени экранирует отрицательный заряд ДНК.
Реактив поставляется в виде порошка свободная кислоты (HEPES free acid, C8H18N2O4S, Mw 238.3) или натриевой соли (HEPES sodium salt, C8H17N2O4SNa, Mw 260.29). Для приготовления стогового раствора можно смешивать свободную кислоту с натриевой солью либо титровать свободную кислоту с помощью NaOH или KOH для достижения желаемого pH. Обычно в качестве стока используют 1М раствор. После растворения HEPES в воде pH находится в пределах 5-6.5. Под действием УФ HEPES окисляется с образованием перекиси, так что хранить раствор на свету противопоказано. Буфер достаточно быстро зарастает плесенью, так что большие объемы готовить не стоит и лучше хранить стерилизованный раствор при 4С.
- Для приготовления желаемого объема 1М HEPES необходимо навесить:
| 50 мл | 100 мл | 200 мл | 250 мл | 500 мл | 1 л | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| HEPES free acid, MW 238.3 | 11.91 г | 23.83 г | 47.66 г | 59.58 г | 119.15 г | 238.3 г |
- Добавить mQ, довести объем до 80% от запланированного
- Довести pH до нужного (обычно pH=7.5) добавлением NaOH, KOH (чтобы повысить pH) или HCl (чтобы понизить pH).
- Довести до запланированного объема
- Стерилизовать через 0.22 мкм фильтр или автоклавированием.
- Хранить при 4С без доступа света.