Олигонуклеотиды (праймеры) - короткие одноцепочечные молекулы ДНК. После получения олигонуклеотиды разводятся до 100 мкМ и хранятся в морозильной камере долгие годы, не теряя своих свойств.
При разведении олигонуклеотидов нужно избегать любых кантаминаций: воду для разведений брать, по возможности, новую; пипетки не должны быть кантаминированы ампликонами; лабораторный стол должен быть чистым; разведение нужно проводить в пре-ПЦР зоне и т.д.
Опыт показывает, что праймеры для ПЦР можно спокойно растворять в mQ. По-видимому, так гораздо проще обеспечить отсутсвие кантаминаций. В то же время, некоторые протоколы советуют использовать для разведения TE или специальный буфер для разведения олигов (Oligo Dilution Buffer: 10 мМ TrisHCl pH8.0 + 10 mM NaCl).
Иногда возникают сложности с ресуспендированием олигов. Если осадок не растворяется полностью, советуют нагреть олиги до 55С в течение 1-5 минут и вортексировать. Некоторые реагенты, применяемые для синтеза олигов могут сохраняться в пробирке с сухими олигами и давать осадок. Они не должны влиять на качество олигов и на ферментативные реакции с ними.
Проверить количество олига в описании производителя. Биоссет к каждой партии олигов предоставляет листок с описанием к каждому праймеру. Нужно обратить внимание на количество олига (Quantity nmoles).
Если в колонке “Quantity nmoles” указано число X меньше 10, то праймер нужно развести в объеме mQ 10*X mkl. В противном случае развести в 102 мкл mQ.
Измерить концентрацию олига c помощью Nanodrop:
Промыть пъедестал с помощью 10 мкл mQ
Выбрать в программе NanoDrop 2000/2000c software Home –> Nucleic Acid
В строке для выбора Type выбрать Oligo DNA
В появившемся поле для ввода внести последовательность олига. В зависимости от последовательности изменится коэффициент экстинкции напротив строки Type
Нанести на пъедестал 2 мкл mQ
Нажать кнопку Blank или клавишу F3 (на ноутбуках Asus компинацию клавиш Fn+F3). Это действие позволит прибору измерить коэффициент поглощения растворителя. Если требуется измерить несколько олигов, то повторно проводить обнуление не нужно.
Удалить жидкость с пъедестала с помощью салфетки. Не допускать трения бумаги о пъедестал, поскольку это может поцарапать поверхность детектора!
Нанести на пъедестал 2 мкл растворенного олига
Нажать кнопку Measure или клавишу F1 (на ноутбуках Asus комбинацию клавиш Fn+F1).
Записать концентрацию олига Y в ng/mkl.
Удалить жидкость с пъедестала с помощью салфетки. Не допускать трения бумаги о пъедестал, поскольку это может поцарапать детектора!
Переключиться на вкладку OligoCalc (в левом нижнем углу приложения). Разделить молярную массу олига (строка Molecular Weight) на 10. Полученное число Z равняется массовой концентрации олига в 100 мкМ растворе (в нг/мкл). Например, если молярная масса олига 6879.32 г/моль, то концентрация в 100 мкМ растворе будет 687.9 нг/мкл
Концентрация олига в пробирке равна 100*Y/Z мкМ.
Если концентрация больше 100 мкМ, то добавить в олиг V*Y/Z - V мкл mQ*,* где ***V*** - это объем олига в пробирке. ***Концентрация олига станет 100 мкМ.***
Написать концентрацию разведенного олига на пробирке.
Если нужно проверить еще один олиг, то записать его последовательность в поле для ввода и провести измерение концентрации не прибегая к повторному обнулению.
Промыть пъедестал с помощью 10 мкл mQ
Хранить разведенные олиги при -20С. Не стоит хранить стоки олигов и ПЦР-продукты в одном пакете или штативе.