Фенол:Хлороформная смесь используется для очистки ДНК из лизатов и реакционных смесей с РНКазой или другими белками. Смесь фенол-хлороформа (пропорция 1:1) уравновешивается 0.1 М TrisHCl c pH8.0. Значение pH имеет важное значение, поскольку определяет растворимость нуклеиновых кислот в водной фазе в присутсвии фенола. РНК остается в водной фазе при кислых и щелочных pH, а ДНК только при щелочных, тогда как кислый pH приводит к переходу ДНК в органическую фазу. Готовить смесь требуется под тягой.
Разморозить фенол в бане с горячей водой (до 68С)
Отмыть стеклянную емкость для фенол-хлороформа 10% SDS и дистиллятом
Приготовить 50-100 мл 0.1М TrisHCl (pH 8.0)
В мерном стакане отмерить равный объем фенола и хлороформа и смешать в бутылке
Налить 10% TrisHCl (pH 8.0) в емкость с фенол-хлороформом
Взболтать смесь и поставить отстаиваться в холодильник на 4С. Удалить излишки верхней водной фазы (оставить слой ~1 см) в слив органики
Хранить при 4С без доступа света
Обычно предлагается использовать смесь ФХИ (фенол:хлороформ:изоамиловый спирт в пропорции 25:24:1). Изоамиловый спирт препятствует вспениванию, его добавление качественно не влияет на выход ДНК.
Фенол со временем окисляется и меняет окраску с прозрачной до желтой. Желтую окраску также преобретает фенол со стабилизаторами. Для предотвращения окисления в фенол добавляют 0.1% гидроксихинолина, а в 0.1М Tris добавляют 0.2% бета-меркаптоэтанол. Как показывает опыт, это не обязательно.
Рецепт из книги CSH на странице 7