X-Gal
X-gal - органическое соединение, состоящее из галактозы, соединенной с индолом. X-gal расщепляется бета-галактозидазами c образованием нерастворимого синего пигмента. X-gal используется для идентификации галактозидазы в клетках бактерий и эукариот. X-gal позволяет визуально определить, какие из колоний E. coli трансформированы нужным вектором. В норме в клетках E. coli фермент, закодированный геном lacZ синтезируется под действием индуктора IPTG, а синее окрашивание теряется у клеток, содержащих генно-инженерную конструкцию, в которой ген lacZ нарушен в результате генетической вставки.
Формула XGal
X-gal расщепляется β-галактозидазами, при этом образуется галактоза и 5-бромо-4-хлоро-3-гидроксииндол (1). Последний окисляется в 5,5’-дибромо-4,4’-дихлоро-индиго (2), нерастворимый окрашенный продукт.
Альтернативные названия
-
X-gal
-
bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside
-
BCIG
-
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl β-D-Galactopyranoside
X-gal для сине-белой селекции E. coli
В лабораторной практике, как правило, используют сток 20 мг/мл в DMF или DMSO (~500-кратный сток), хотя при рабочей концентрации 50-100 мкг/мл такое количество DMF и DMSO может быть токсичным для клеток. Можно готовить более концентрированные стоки (100-200 мг/мл), хотя длительность хранения X-gal, как предупреждают производители, сильно сокращается. Для сине-белой селекции мы готовим сток 50 мг/мл (~1000x сток). Чем выше концентрация X-gal в агаре, тем ярче и быстрее будут окрашиваться колонии.
- Для приготовления 50 мг/мл (~1000-кратного) стока X-gal нужно навесить указанное количетсво порошка:
| 1000x cток | 5 мл | 10 мл | 15 мл | 20 мл |
|---|---|---|---|---|
| X-gal | 0.250 г | 0.500 г | 0.750 г | 1 г |
-
Добавить 80% объема DMSO, растворить
-
Довести объем DMSO до желаемого
-
Расфасовать по 1 мл
-
Хранить при -20С без доступа света. Со временем сток из бесцветного превращается в желтый. Это не сильно влияет на результат селекции. Как предупреждает Sigma, окрашенные фасовки необходимо сразу выкидывать.
Описание X-gal и протоколы сине-белой селекции
Концентрации стоков и рабочих растворов могут варьировать от протокола к протоколу. Лучше ориентироваться на собственный опыт.
Описание X-Gal и протокол селекции от Meridian