Протеиназа К - сериновая протеаза широкого спектра. Обнаружена в 1974 году в экстракте грибка Engyodontium album (Tritirachium album). Протеиназа К не обладает специфичностью и расщепляет широкий спектр белков, включая кератин, РНКазы и ДНКазы.
Ферментативная активность протеиназы К осуществляется в присутсвии ионов кальция. В отсутствие Ca, или под действием хелатирующих агентов активность фермента снижается не полностю (на 80%), что позволяет очищать препараты ДНК в присутсвие ЭДТА. Кальций при этом, необходим для увеличения стабильности фермента и препятствует автолизу. Детергенты (0.5-1% SDS), соли гуанидина или мочевина, а также нагревание увеличивают доступность белков для фермента и ускоряют гидролиз. Активность фермента поддерживается в широком спектре pH, оптимум достигается при pH 8. Оптимальная температура 50-65С, хотя температура выше 65С ингибирует реакцию. Инактивация фермента возможна нагреванием до 95С (10мин), а также добавлением PMSF. Стоковые растворы готовят, как правило, в буферном растворе с добавлением Ca и концентрацией фермента 20 мг/мл.
Приготовить нужный объем буферного раствора 200мМ Tris-HCl pH8 + 3 mM CaCl2 из стоков:
| 1 ml | 2 ml | 4 ml | 5ml | |
|---|---|---|---|---|
| 1M Tris-HCl pH8 | 200 mkl | 400 mkl | 800 mkl | 1000 mkl |
| 2.5M CaCl2 | 1.2 mkl | 2.4 mkl | 4.8 mkl | 6 mkl |
| mQ | 798.8 mkl | 1597.6 mkl | 3195. 2 mkl | 3994 mkl |
Растворить 20 мг Протеиназы К в 500 мкл буферного раствора
Добавить равный объем глицерина
Стерилизовать раствор фильтрацией через 0.22 мкм фильтр
Хранить аликвоты при -20С.
Состав стокового раствора: Протеиназа К (20 мг/мл), 100мМ Трис pH8, 1.5 мМ CaCl2, глицерин 50%.
Глицерин препятствует заморозке. При необходимости вместо глицерина можно добавить равный объем mQ. Замороженные стоковые растворы нужно аликвотировать, так как фермент недостаточно устойчив к множественным заморозкам-разморозкам.