РНКаза А
РНКаза А - это эндорибонуклиаза из телячей поджелудойной железы, которая разрезает фосфодиэфирные связи одноцепочечной РНК после пиримидиновых нуклеотидов, атакуя 3'-фосфатную группу. Например, pG-pG-pC-pA-pG разрезается с образованием pG-pG-pCp и А-pG. РНКаза А является одноцепочечным полипептидом с четыремя цистеиновыми мостиками. Как и другие рибонуклеазы РНКаза А не гидролизует ДНК из-за отсутсвия в последней 2'-OH групп, необходимых для образования циклических интермедиатов. Также РНКаза А гидролизует РНК в белковых образцах. Активаторами РНКазы являются соли натрия и калия. Фермент крайне устойчив, выдерживает даже кипячение. Ингибируется в присутсвии гуанидина, ионов тяжелых металлов. Коммерческие ингибиторы РНКазы чаще всего представляют собой генно-инженерные белки на основе белка RI (Ribonuclease Inhibitor) из плаценты млекопитающих.
Работать с РНКазой стоит крайне аккуратно. Микроскопические загразнения пипеток приводят к деградации РНК в образцах. По этой причине для работы с РНК используются отдельные пипетки.
Стоковый раствор РНКазы (10 мг/мл)
-
Растворить фермент в mQ из расчета 20 мг РНКазы на мл
-
Вскипятить раствор с РНКазой в водяной бане в течение 15 минут. Охладить баню до комнатной температуры. Этот шаг неободим для устранения ДНКаз и протеаз.
Необходимо закрепить пробирку с РНКазой так, чтобы она ни в коем случае не перевернулась и не погрузилась в воду, иначе вода из бани попадет в пробирку. На всякий случай стоит пометить уровень жидкости в пробирке до кипячения. Так вы точно убедитесь, что вода не проникла в пробирку.
-
Добавить равный объем глицерина, размешать.
-
Расфасовать сток по эппендорфам
-
Хранить аликвоты при -20С
В некоторых протоколах советуют использовать для разведения РНКазы буфер Tris-Cl (10 mM, pH 7.5)+ NaCl (15 mM) или TE (pH 7.6). Производители отмечают, что кипячение РНКазы в растворах с нейтральным или кислым pH может вызывать преципитацию фермента и потерю активности. По нашему опыту использовать буфер не обязательно.