Переосаждение ДНК этанолом

Переосаждение нуклеиновых кислот спиртами используется для концентрирования и/или очистки образцов от солей, нуклеотидтрифосфатов, ферментов, других растворимых в спирте молекул и, в какой то степени, от одноцепочечных олигонуклеотидов. Осаждение спиртами основано на том факте, что нуклеиновые кислоты менее растворимы в спирте, чем в более полярной воде. Добавление соли и снижение температуры дополнительно понижает растворимость из-за конкуренции за диполи воды. Подробнее на википедии.

Время выполнения

от 40 минут

Необходимые реактивы

  • 3M ацетат натрия или 5M aцетат аммония

  • Соосадитель (опционально): гликоген, тРНК или линейный полиакриламид

  • 96% этанол или 100% этанол

  • 70% этанол

  • mQ или TE

Протокол переосаждения ДНК этанолом

  1. Добавить 1/10 объема 3M ацетата натрия, pH 5,2 или 1/2 объема 5M ацетата аммония
  2. Добавить 3 объема 96% этанола или 2 объема 100% этанола. При необходимости добавить соосадитель (20 мкг гликогена, тРНК или линейный полиакриламид)
  3. Перемешать и заморозить на ночь при температуре -20 ° C. Некоторые считают этот шаг ненужным. Если вы спешите, вы также можете поставить образец на -80С от десяти минут до нескольких часов. Также подойдет сухой лед на 10-15 минут. Длительное время инкубации при низких температурах имеет решающее значение для небольших фрагментов.
  4. Центрифугировать 10-30 минут при 4С на максимальных оборотах.
  5. Удалить супернатант, не задевая осадок.
  6. Промыть осадок с 1 мл 70% этанола.
  7. Центрифугировать 5 минут при 13000g. Можно как при комнатной температуре, так и на +4C.
  8. Удалить супернатант полностью. При необходимости повторить центрифугирование и избавиться от спирта пипеткой на 20 мкл.
  9. Сушить 3-5 минут. Длительная сушка приведет к низкому выходу, так как пересушенная ДНК не растворяется в воде.
  10. Растворить в нужном объеме mQ или TE.

Ацетат аммония предпочтителен перед NaOAc во время переосаждения длинных фрагментов ДНК. Двухкратное переосаждение этанолом в присутствии ацетата аммония достаточно для удаления дцДНК длиной <30bp.Для этого нужно после первого центрифугирования удалить спирт, ресуспендировать осадок в воде или ТЕ и снова добавить равный объем ацетата аммония с последующим осаждением этанолом. В то же время нельзя использовать переосаждение с ацетатом аммония перед реакциями с полинуклеотидкиназой, поскольку аммоний ингибирует этот фермент.

Если концентрация SDS в образце >0.5%, то вместо NaOAc стоит добавлять в образец NaCl до 200мМ.

Если количество ДНК в образце меньше 100 нг, то вместе с изопропанолом нужно добавлять соосадитель.

Сушка необходима для удаления спирта. Этанол является ингибитором ферментативных реакций, так что недостаточное избавление от спирта может помешать последующим процедурам. Судить о наличии спирта можно по значениям A260/230«1.8.

Опыт показывает, что осадок ДНК может спокойно храниться в этаноле долгое время. Не стоит злоупотреблять этим, если образец содержит соли и детергенты, ингибирующие ферментативные реакции.

Дополнительные источники

Центр коллективного пользования “ГЕНОМ” при ИМБ РАН предлагает достаточно простой протокол очистки ПЦР от dNTP и олигонуклеотидов с этанолом и ацетатом аммония на комнатоной температуре. Смотреть здесь.

Tan - 2009 - DNA, RNA, and Protein Extraction The Past and The Present

Moore - 2002 - Purification and Concentration of DNA from Aqueous Solutions

Ali - 2017 - Current Nucleic Acid Extraction Methods