Переосаждение изопропанолом

Переосаждение нуклеиновых кислот спиртами используется для концентрирования и/или очистки образцов от солей, ферментов, нуклеотидтрифосфатов, других растворимых в спирте молекул и, в какой то степени, от одноцепочечных олигонуклеотидов. Осаждение спиртами основано на том факте, что нуклеиновые кислоты менее растворимы в спирте, чем в более полярной воде. Добавление соли и снижение температуры дополнительно понижает растворимость из-за конкуренции за диполи воды. Подробнее на википедии.

Переосаждение ДНК изопропанолом (пропанолом 2) является достаточно быстрым и простым методом очистки ДНК из реакционных смесей. Осаждение изопроманолом дает меньше ДНК, чем осаждение этанолом (по слухом выход меньше в два раза), в то же время изпропанол при комнатной температуре снижает риск соосаждения солей, которые могут помешать дальнейшим экспериментам. Изопропанол предпочтительнее для больших объемов ДНК, поскольку требуется меньше спирта, к тому же этот метод быстрее, поскольку не требует стадии охлаждения. Стекловидный преципитат, полученный после осаждения изопропанолом труднее увидеть, чем пушистые, содержащие соль гранулы от осаждения этанолом. В изопропаноле осадок слабее прикрепляются к стенкам полипропилленовых пробирок после центрифугирования. В то же время, выход реакции можно легко увеличить добавлением соосадителей (гликоген, линейный полиакриламид, тРНК) или заморозкой.

Время выполнения

от 30 минут

Необходимые реактивы

  • 3M ацетат натрия

  • Соосадитель (опционально): гликоген, тРНК или линейный полиакриламид

  • Изопропанол

  • 70% этанол

  • mQ или TE

Протокол переосаждения ДНК изопропанолом

  1. Доведсти объем реакции до 270 мкл
  2. Добавить 30 мкл (1/10 объема) 3M NaOAc и перемешать. Концентрация NaOAc должна быть 300 мМ. При необходимости добавить соосадитель (20 мкг гликогена, тРНК или линейный полиакриламид)
  3. Добавить 450 мкл изопропанола. Перемешать. Для лучшего выхода поместить в морозильную камеру или кельвинатор на 15 минут.
  4. Центрифугировать 10-20 минут при 13000g. Можно как при комнатной температуре, так и на +4С.
  5. Удалить супернатант, не задевая осадок.
  6. Промыть осадок с 1 мл 70% этанола.
  7. Центрифугировать 5 минут при 13000g. Можно как при комнатной температуре, так и на +4C.
  8. Удалить супернатант полностью. При необходимости повторить центрифугирование и избавиться от спирта пипеткой на 20 мкл.
  9. Сушить 3-5 минут. Длительная сушка приведет к низкому выходу, так как пересушенная ДНК не растворяется в воде.
  10. Растворить в нужном объеме mQ или TE.

После добавления спирта нужно следить, чтобы крышка пробирки была закрыта максимально плотно, иначе остатки спирта остаются на стенках крышки, что делает проблематичным удаление оного

Оптимальное количество изопропанола для переосаждения ДНК - 1-1.5 к 1. Доводить объем реакции до 300 мкл перед добавлением изопропанола не обязательно, но удобно.

Если количество ДНК в образце >1 мкг, то охлаждать с изопропанолом не обязательно.

Если концентрация SDS в образце >0.5%, то вместо NaOAc стоит добавлять в образец NaCl до 200мМ.

Если количество ДНК в образце меньше 100 нг, то вместе с изопропанолом нужно добавлять соосадитель.

Сушка необходима для удаления спирта. Этанол является ингибитором ферментативных реакций, так что недостаточное избавление от спирта может помешать последующим процедурам. Судить о наличии спирта можно по значениям A260/230«1.8.

Опыт показывает, что осадок ДНК может спокойно храниться в этаноле или изопропаноле многие дни. Не стоит злоупотреблять этим, если образец содержит соли и детергенты, ингибирующие ферментативные реакции.

Дополнительные источники

Tan - 2009 - DNA, RNA, and Protein Extraction The Past and The Present)

Moore - 2002 - Purification and Concentration of DNA from Aqueous Solutions)

Ali - 2017 - Current Nucleic Acid Extraction Methods)