Для очистки секвенирующих реакций мы используем:
Очистку этанолом/EDTA (описана в мануале BigDye, главы с 4-2 по 4-9, или на protocols.io)
Очистку смолой BigDye XTerminator Purification Kit
Очистку с помощью 5% смолы Sephadex G-50
Время работы
1 час
Необходимые расходники
5% смола Sephadex G-50. Перед использованием взболтать.
mQ
Ножницы
1.5 мкл эппендорфы
Носики с фильтрами на 20 или 200 мкл
Протокол очистки
С помощью ножниц проделать в крышке эппендорфа отверстие
Отрезать кончик носика (~ 15 мм), не задевая фильтр
Поместить обрезанный носик с фильтром вертикально в отверстие на крышке эппендорфа
Залить 200-400 мкл смолы Sephadex в носик поверх фильтра (жидкость не должна подниматься над верхушкой носика)
Центрифугировать эппендорф с импровизированной колонкой 1 минуту при 900 g
Снова залить смолу в носик с сефадексом (200-400 мкл)
Опять центрифугировать эппендорф 1 минуту при 900 g
Залить 100-300 мкл mQ в носик поверх сефадекса (жидкость не должна подниматься над верхушкой носика)
Опять центрифугировать импровизированную колонку 2 минуты при 900 g
Сделать новый эппендорф с отверстием в крышке и поместить в него колонку
Перенести образец секвенирующей реакции в слой сефадекса, образовавшийся поверх фильтра
Центрифугировать эппендорф с колонкой 2 минуты при 900g. Все, что прошло через колонку и опустилось на дно пробирки и есть очищенная реакция
Выкинуть носик из эппендорфа и выкинуть.
Осушить очищенную меченную ДНК в вакуумной центрифуге (режим V-AQ, продолжительность 20-30 минут). Вода должна испариться полностью
Передать пробирку с высушенным образцом на секвенирование
Высушить очищенную сефадексом меченную ДНК нужно сразу же. Как только вакуумная центрифуга остановится, нужно проверить, что вода полностью высохла. Длительное нахождение меченной ДНК в воде полностью испортит секвенируюущую реакцию. После сушки очищенная секвенирующая реакция стабильна несколько суток при 4С.