Sephadex-G50
Смола Sephadex G-50
Для очистки секвенирующих реакций мы используем Sephadex G50 fine. Согласно инструкции эта смола используется для отделения молекул >30 кДа от молекул <1500 Да. Мелкие молекулы задерживаются в шариках смолы, что позволяет очищать реакционные смеси от невключившихся меченых неуклеотидов.
Подробное описание физических принципов метода эксклюзионной хроматографии с использованием Sephadex можно прочитать в прикрепленном файле.
Рецепт 5% смолы для очистки секвенирующих реакций.
-
Разбавить 𝑿 г порошка Sephadex G-50 в 20*𝑿 мл mQ-воды.
-
Перемешать сорбент и оставить для набухания на 3 часа при комнатной температуре.
Разбавленный сорбент должен храниться на +4С. Длительное хранение возможно только после добавления азида натрия до 0.005%. Если азид не добавлять, то сорбент в течение недели зарастет грибком, что легко определить по появлению черных хлопьев.
На очистку одной реакции требуется от 400 до 1000 мкл разведенного сорбента.
Справка
Сефадекс - это перекрестно сшитый декстран, используемый для гель-фильтрации. Он был разработан Джеркером Поратом и Пером Флодином и выпущен компанией Pharmacia в 1959 году. Название происходит от separation Pharmacia dextran.
Сефадекс входит в состав анионо- и катионообменных хроматографических сред, а также гелевые фильтрационных смол, которые сотоят из макроскопических шариков, полученных синтетическим путем из полисахарида декстрана. Органические цепи декстрана сшиваются, образуя трехмерную сеть с функциональными ионными группами, присоединенными к глюкозным звеньям полисахаридных цепей эфирными связями. Варьируя степень сшивания декстрана, можно изменять фракционные свойства геля. Размеры шариков сефадекса находятся в диапазоне от 20 до 300 мкм.
Сефадекс G представляет собой гель-фильтрующую среду, полученную сшиванием декстрана с эпихлоргидрином. Различные типы сефадекса отличаются степенью сшивания и, следовательно, степенью набухания и диапазоном их молекулярного фракционирования. Сефадекс G-50 является одним из пяти разных типов G от G-10 для небольших молекул до G-75 для более крупных молекул. У Cytiva шарики Sephadex G-50 предоставляется в четырех размерных диапазонах (самые большие coarse, затем medium, fine и самые мелкие superfine). Чем меньше размер шариков, тем более высокая эффективность очистки.