Экстракция c полиэтиленгликолем (ПЭГ, PEG) является быстрым и сравнительно простым методом очистки дцДНК из реакционных смесей, таких как ПЦР и реакции рестрикции, от ферметнтов, dNTPs и праймеров. Преимуществом метода является возможность избавляться от фрагментов дцДНК малого размера, например, праймеровых димеров, что труднодостижимо при очистке на колонках или переосаждении спиртом. Изменяя концентрацию ПЭГ, можно регулировать диапазон длины исключенных из препарата фрагментов ДНК.
Эффективность осаждения с PEG в присутствии MgCl2 сильно падает, когда концентрация ДНК в растворе меньше 10 нг/мкл. Для количественного осаждения или очистки убедитесь, что в растворе достаточно ДНК. Это можно сделать с помощью электрофореза.
40 - 90 минут
Соосадитель (опционально): гликоген, тРНК или линейный полиакриламид
70% этанол
mQ или TE
1. Довести объем реакции до 100 мкл с помощью mQ.
Доводить до 100 мкл не обязательно. Это делается для удобства. Убедитесь, что при разбавлении концентрация ДНК не падает ниже 10 нг/мкл.
2. Добавить 50 мкл (половину объема) стокового раствора PEG-8000+30мМ MgCl2. Итоговая концентрация MgCl2 должна быть 10 мМ.
Трехкратный стоковый раствор 45%PEG-8000+30mM MgCl2 используется для очистки ПЦР-продуктов от праймеровых димеров. С использованием такого стока концентрация PEG в растворе с ДНК будет 15%, что позволяет избавиться от ДНК<100-150bp. При необходимости можно довести сток до желаемой концентарции PEG добавлением нужного объема 30 мМ MgCl2.
PEG-8000 — это полимерный этиленгликоль с молекулярной массой 8000 Да. Для переосаждения ДНК подходят и другие марки полимера, например, PEG-6000. Правда молекулярная масса может повлиять на селективные свойства полимера. О влиянии ионного состава и концентрации PEG на выход реакции читайте в источниках в конце текста.
3. Центрифугировать 15 минут на 10000g при комнатной температуре. Теоретически, перед центрифугированием можно подождать некоторое время - это может улучшить выход.
Здесь и дальше осадок не будет заметен, так что нужно пометить часть пробирки, в которой должен выпасть осадок, с помощью маркера. В дальнейшем нужно ориентировать пробирку относительно одинаковым способом.
4. Удалить супернатант, не задевая осадок.
5. Чтобы избавиться от остаточных солей и PEG, промыть осадок с 1 мл 70% этанола. Центрифугировать >5 мин при >10000g на комнатной температуре.
6. Удалить супернатант, не задевая осадок. Можно повторить отмывку этанолом для более качественной очистки, затем снова центрифугировать.
7. Сбросить остатки этанола центрифугированием и отобрать супернатант по-максимому с помощью микропипетки на 20 мкл.
8. Осушить осадок в течение 3-5 минут до исчезновения следов этанола.
Сушить осадок нужно не больше 5 минут. Пересушенная ДНК плохо растворяется в воде.
9. Растворить осадок в нужном объеме mQ или TE.
При уменьшении концентрации PEG селективные свойства полимера изменяются, позволяя удалять из препарата более длинные молекулы ДНК.
| Концентрация PEG в растворе с ДНК + 10мМ MgCl2 | Минимальная длина осажденной ДНК |
|---|---|
| 10% | ~300bp |
| 6% | ~500bp |
| 5% | ~700bp |
| 4% | ~1000bp |
Эффективность осаждения ДНК сильно падает при концентрациях PEG меньше 10%
Полимерный полиэтиленгликоль способен вытеснять молекулы ДНК из водных растворов в присутствии катионов Na, K или Mg. Опуская физическую природу явления, кратко этот эффект можно объяснить следующим образом: полимер PEG заполняет объем реакционной смеси, выталкивая ДНК в оставшееся пространство (больше PEG - меньше свободного пространства). В то же время положительно заряженные катионы притягиваются к отрицательно заряженным фосфатным группам нуклеиновой кислоты и экранируют заряд ДНК. В результате экранирования и в отсутсвие достаточного пространства длинные молекулы ДНК конденсируются и выпадают в осадок, тогда как короткие молекулы ДНК остаются растворены в свободном пространстве водной фазы. Таким образом, чем выше концентрация PEG и катионов, тем короче молекулы ДНК, выпавшие в осадок.
Подробнее о физических принципах переосаждения, влиянии ионного состава, параметрах выхода и вариациях протокола очистки можно прочитать в источниках ниже