Фенол-хлороформная экстракция является классическим методом очистки нуклеиновых кислот из различных источников начиная от клеточных лизатов до реакционных смесей. Метод легко оптимизируется под любые стартовые количества ДНК и позволяет добиваться высокой степени очистки как ДНК, так и РНК.
Протокол очистки состоит из трех этапов:
- Преципитация белков под действием фенол:хлороформа.
- Очистка от фенола под действием хлороформа.
- Переосаждение нуклеиновых кислот с помощью изопропанола.
Если в образце перед очисткой есть РНК, то можно модифицировать протокол следующим образом:
- Преципитация белков под действием фенол:хлороформа.
- Обработка образца РНКазой.
- Удаление РНКазы под действием фенола (опционально)
- Очистка от фенола под действием хлороформа.
- Переосаждение нуклеиновых кислот с помощью изопропанола.
от 40 минут
Опционально: РНКаза А
Хлороформ
3M ацетат натрия или 5M NaCl
Соосадитель (опционально): гликоген, тРНК или линейный полиакриламид
Изопропанол
70% этанол
mQ или TE
1. Довести объем образца до 300-700 мкл с помощью mQ.
Поскольку после добавления фенола объем реакции увеличится в 2 раза, необходимо проконтролировать, чтобы конечный объем помещался в 1.5 мл эппендорф. Объемы меньше 300 мкл неудобны, так как приведут к бОльшим потерям ДНК из-за невозможности полностью разделить водную и органическую фазу.
2. Добавить равный объем фенол-хлороформной смеси. Тщательно перемешать содержимое, переворачивая пробирку в руках 8-10 раз. Центрифугировать 5-10 минут на 13000g.
После центрифугирования водная фаза остается сверху, фенол-хлороформ – снизу, а на границе фаз образуется тонкий слой белкового преципитата. Если фенол был уравновешен буфером с нейтральной кислотностью (pH 7-8), то водная фаза будет содержать сразу и ДНК, и РНК. Если фенол был уравновешен кислым буфером (pH 4-6), то ДНК осядет на границе между фазами, а РНК – останется в водном слое.
Лизаты и некоторые реакционные смеси содержат высокую концентрацию SDS, который имеет тенденцию выпадать в осадок при температурах ниже комнатной, образуя плотные белые хлопья. Если такое произошло, стоит прогреть образец до 37С.
3. Верхнюю фазу аккуратно отобрать пипеткой, избегая попадания осадка или фенола, и перенести в новую пробирку.
Чтобы не задевать преципитат и нижнюю фазу, лучше выставить на пипетке объем, равный 95% от начального. Таким образом часть жидкости будет потеряно, но загрязнители останутся в пробирке. Пожертвовать 5% образца ради качественной очистки совсем не страшно.
3a. При необходимости. Добавить РНКазу А (рабочая концентрация от 1 до 100 мкг/мл). Инкубировать при 37C в течение 5-20 минут.
Если пропустить этот этап, когда в образце есть РНК, то оценить концентрацию ДНК спектрофотометрически станет невозможно, поскольку этот метод не разделяет ДНК и РНК. Очистку образца от РНКазы производят с помощью фенол-хлороформной смеси, хотя если глубокая очистка не требуется, то можно сразу обработать хлороформом или переосадить ДНК спиртом.
3б. Если добавили РНКазу. Добавить равный объем фенол-хлороформной смеси. Тщательно перемешать содержимое, переворачивая пробирку в руках 8-10 раз. Центрифугировать 5-10 минут на 13000g. Верхнюю фазу аккуратно отобрать пипеткой, избегая попадания преципитата или фенола, и перенести в новую пробирку.
Повторная очистка фенолом необходима для окончательного удаления белков. Этот этап можно пропустить если обработка РНКазой не проводилась и белковый преципитат от предыдущей очистки не попал в образец. О присутсвии белков будет говорить низкое значение A260/A280, полученное после измерения оптических свойств образца на спектрофотометре.
4. Добавить равный объем хлороформа. Перемешать содержимое, переворачивая пробирку в руках 8-10 раз. Энергичное встряхивание может привести к фрагментации ДНК. Центрифугировать 5-10 минут на 13000g.
Очистка хлороформом проводится для удаления фенола. Если вы уверены, что фенол не помешает в последующей работе, то очистку хлороформом можно пропустить. О присутсвии фенола будет говорить низкое значение A260/A280, полученное после измерения оптических свойств образца на спектрофотометре.
Хлороформ обладает высокой текучестью и свободно вытекает из наконечника пипетки. Чтобы избежать этого, один раз наберите хлороформ в наконечник пипетки и слейте. Под действием хлороформа полипропиленовый наконечник набухнет, что уменьшит эффективный диаметр отверстия в наконечнике и предотвратит вытекание хлороформа из наконечника. Также из-за хлороформа полипропиленовые пробирки могут повреждаться при центрифугировании с высокими перегрузками, так что при очистке хлороформом избегайте скоростей вращения больше 13000g.
5. Верхнюю фазу аккуратно отобрать пипеткой, избегая попадания капель хлороформа, и перенести в новую пробирку.
6. Если концентрация SDS в растворе меньше 0.5%, то добавить к водной фазе 1/10 объема 3М NaOAc (pH ~5.3). Итоговая концентрация NaOAc должна быть 300 мМ. В противном случае добавить 0.04 объема 5М NaCl (концентарция будет 200 мМ).
Ионы натрия необходимы для осаждения ДНК в изопропаноле. NaOAc легко растворяется в изопропаноле, но также приведет к осаждению SDS вместе с ДНК. SDS является ингибитором ферментативных реакций. Для растворов с высокой концентрацией SDS лучше применять NaCl
Если концентрация NaOAC или NaClв реакционной смеси была >200 mM до добавления фенола (NaCl является компонентом лизирующих буферов), то можно пропустить этот этап. Если вы не уверены, то добавлять Na нужно обязательно.
7. Добавить 1,5 объема изопропанола и тщательно перемешать. Центрифугировать 15-20 минут на 13000g.
Спирты осаждают нуклеиновые кислоты из солевых растворов. Преимуществом изопропанола является небольшой объем спирта, необходимый для проведения экстракции (пропорции 1-1.5 к 1 для изопропанола и 2.5 к 1 для этанола). Кроме того, для осаждения этанолом образец необходимо замораживать в течение длительного промежутка времени. однако изопропанол испаряется дольше этанола и осаждает больше солей.
При концентрациях ДНК >50-100 нг/мкл осаждение ДНК изопропанолом будет количественным и все отмывки со спиртами можно спокойно проводить при комнатной температуре, особенно если оставить образец на столе на 10-20 минут. Однако при меньших количествах ДНК стоит использовать холодные растворы спиртов и центрифугировать образцы при 4С. Еще больше эффективность осаждения ДНК, если перед центрифугированием заморозить образец на -20 или -80 от 30 минут до ночи с последующим центрифугированием на +4С. Максимальный выход будет достигнут (особенно в образцах <1 нг/мкл ДНК), если перед заморозкой добавить в образец соосадитель: гликоген, линейный полиакриламид или тРНК. Мы чаще всего используем гликоген (20-40 мг на образец). В отличие от полиакриламида или тРНК, гликоген прозрачен на 260 нм и не мешает измерять концентрацию ДНК спектрофотометрически.
Если источником ДНК служит клеточный лизат, то после добавления изопропанола следует сразу приступать к центрифугированию и отмывке этанолом. Не стоит замораживать такие образцы или долго держать в изопропаноле. Это приведет к загрязнению образцов солями, SDS и другими ингибиторами ПЦР.
Нужно следить, чтобы крышка пробирки была плотно закрыта, и жидкость не смачивала края крышки, иначе возникнут трудности с последующей сушкой ДНК.
8. Аккуратно удалить супернатант, не задевая осадок.
В результате центрифугирования ДНК осаждается на дно пробирки в виде плотного бесцветного или желтоватого комка. Чем чище образец, тем прозрачнее осадок. Если ДНК мало, то стоит осаждать ее в присутсвии соосадителя (см. выше). Гликоген, например, образует плотный белый осадок и делает возможным безопасное удаление спирта.
Осадок редко прилипает ко дну пробирки и может легко угодить в наконечник пипетки. Если это произошло, слейте некоторое количество супернатанта обратно, пока осадок не вернется в пробирку, и повторите центрифугирование в течение нескольких минут.
9. Добавить 1 мл 70% этанола и перемешать. Центрифугировать 5 минут на 13000g.
В этаноле ДНК представляет собой белый осадок, напоминающий вату. Чем больше ДНК, тем больше осадок.
Нужно следить, чтобы крышка пробирки была плотно закрыта, и жидкость не смачивала края крышки, иначе возникнут трудности с последующей сушкой ДНК.
10. Аккуратно удалить супернатант, не задевая осадок. При необходимости центрифугировать пробирку еще раз. Высушить осадок при комнатной температуре в течение 2-5 минут.
Спирты ингибируют ферментативные реакции, поэтому перед растворением ДНК супернатант нужно удалить полностью. Удобно отбирать спирт сначала 1.5 мл пипеткой, а остатки удалить пипеткой на 20 или 200 мкл. Если отбирать жидкость медленно, она не будет образовывать капли на стенках, что позволит избежать дополнительного центрифугирования. Нужно следить, чтобы жидкость не оставалась на краях крышки. Жидкость с крышки можно удалить пипеткой на 20 мкл.
Время сушки может варьировать. Не стоит сушить больше 5 минут и применять вакуумную сушилку, так как пересушенный осадок дцДНК не растворяется в воде. В Если спирт не удалось удалить полностью, придется ждать полного испарения. В процессе сушки осадок становится прозрачным, отчего его может быть трудно разглядеть.
11. Растворить осадок в нужном объеме воды или TE.
Основы метода фенольной экстракции и лежащие в основе физические принципы можно подчерпнуть из следующих статей:
Tan - 2009 - DNA, RNA, and Protein Extraction The Past and The Present
Moore - 2002 - Purification and Concentration of DNA from Aqueous Solutions